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针对上述问题，复旦大学步文博、姚振威和南京医科大学方向明教授团队设计了一种功能化纳米材料NaGdF₄@PDA-ALD纳米颗粒（NPANs），用于护航MSCs治疗缺血性卒中。NPANs以NaGdF₄为核心，外层包覆聚多巴胺（PDA）用于高效清除ROS，并进一步偶联阿仑膦酸钠（ALD）用于螯合细胞内Ca²⁺。NPANs被MSCs内化后，有效保护其免受氧化损伤和钙超载，促进细胞存活和功能维持。同时，NaGdF₄给予T₁加权MRI信号增强，实现移植MSCs的活体无创示踪。NPANs标记的MSCs成功迁移至缺血区域，促进血流恢复和血管生成，显著改善卒中治疗效果。。该文章于 2025 年 01 月 29 日以《Mesenchymal Stem Cells With Polydopamine-Coated NaGdF4 Nanoparticles with Ca²⁺ Chelation Ability for Ischemic Stroke Therapy》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202416020）。

方案1. 纳米颗粒辅助间充质干细胞（MSCs）策略改善缺血性卒中治疗示意图。缺血区域过量的活性氧（ROS）和钙离子（Ca²⁺）积累损害 MSCs 存活。NaGdF₄ 纳米颗粒包覆聚多巴胺（PDA）并偶联阿仑膦酸钠（ALD）形成 NaGdF₄@PDA-ALD 纳米颗粒（NPANs）。PDA 修饰高效清除 ROS，ALD 螯合细胞内 Ca²⁺。顺利获得调控内质网（ER）-Ca²⁺-线粒体通路，NPANs 保护 MSCs 免受缺血引起的细胞内有害影响，促进其存活并增强血管生成，从而改善卒中治疗效果。

（1）NPANs 的合成与表征

顺利获得将油酸修饰的 NaGdF₄ 纳米颗粒分散于 pH 9.5 的多巴胺溶液中，成功包覆 PDA 层形成 NaGdF₄@PDA 纳米颗粒，随后室温下与 ALD 偶联得到最终产物 NPANs。TEM 显示 NaGdF₄ 和 NPANs 均呈均匀球形分布（图 1b）。XRD 证实 NPANs 保持立方相结构（JCPDS No.027-0699）。FT-IR 光谱中，油酸的特征吸收峰（2854 cm⁻¹、2925 cm⁻¹、1417 cm⁻¹、1568 cm⁻¹）被 PDA 的 N-H 伸缩振动峰（1635 cm⁻¹、1516 cm⁻¹）取代，并在 1080 cm⁻¹ 处出现 P-O 伸缩振动新峰，证实 PDA 包覆和 ALD 修饰成功（图 1c）。NPANs 的 Zeta 电位为 −12.6±0.27 mV，平均水动力学粒径为 132.60±1.02 nm。自由基清除实验表明，NPANs 能有效清除 DPPH•（517 nm 处特征吸收降低，图 1d）和 PTIO•（557 nm 处吸收降低，图 1e），证实 PDA 涂层的高效 ROS 清除能力。XPS 分析显示，NPANs 在模拟体液中表现出显著的 Ca²⁺ 螯合能力，Ca(2p) 峰明显强于 NaGdF₄@PDA（图 1f）。3T MRI 测试显示 NPANs 具有高的 T₁ 弛豫率 r₁=17.16 mM⁻¹s⁻¹，约为临床造影剂 Magnevist（r₁=3.6 mM⁻¹s⁻¹）的 4.77 倍（图 1g）。此外，Ca²⁺ 诱导 ALD 分子在 NPANs 表面聚集，以及 ROS 使 PDA 表面形成多孔纳米结构，均增强了 T₁ 信号强度（图 1h,i），使 NPANs 兼具 ROS 清除、Ca²⁺ 螯合和 MRI 示踪三重功能。

图1. NPANs 的合成与表征。a) NaGdF₄@PDA-ALD 纳米颗粒（NPANs）的合成示意图；b) NPANs 的 TEM 图像，比例尺分别为 50 nm 和 20 nm；c) NaGdF₄、NaGdF₄@PDA 和 NPANs 的 FT-IR 光谱；d,e) NPANs 对 DPPH•（d）和 PTIO•（e）自由基的清除活性；f) NPANs 与 NaGdF₄@PDA 在模拟体液中螯合 Ca²⁺ 的 XPS 分析；g) NPANs 的 T₁ 弛豫率（r₁）；h,i) 不同 Ca²⁺ 浓度（h）和 H₂O₂ 浓度（i）下 NPANs 的 T₁ 信号强度。

（2）MSCs 标记与表征

理想的干细胞标记方法应具备安全性和生物相容性。CCK-8 实验表明，1600 μg mL⁻¹ NPANs 处理下 MSCs 存活率 >80%，确定为安全无毒的最佳标记浓度。流式细胞术显示 NPANs-FITC 的摄取效率随时间增加，24 h 达到平台期，故选择 24 h 为最佳共孵育时间。CLSM 证实 NPANs-FITC（绿色荧光，490–495 nm）主要定位于 MSCs 细胞质中（图 2a），电镜进一步显示 NPANs 内化并扩散至胞质，细胞膜上未检测到纳米颗粒（图 2b）。表面标志物分析表明，1600 μg mL⁻¹ NPANs 标记的 MSCs 仍保持 CD90⁺、CD105⁺、CD44⁺，CD45⁻、CD14⁻、CD34⁻ 的表型特征（图 2c），与未标记 MSCs 一致。分化实验证实 NPANs 标记 MSCs 仍具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能，血管管形成行为也与未标记 MSCs 相似。因此，NPANs 标记不影响 MSCs 的干性特征和体外功能。

图2. MSCs 对 NPANs 的内化及表征。a) MSCs 吞噬 NPANs（绿色）的 CLSM 图像，比例尺 = 50 μm；b) 37°C 孵育 24 h 后 MSCs 的电镜图像，红色箭头指示 NPANs，比例尺 = 2.5 μm；c) MSCs 表面标志物流式鉴定，红色：NPANs 标记 MSCs，灰色：未标记 MSCs。

（3）NPANs 对 MSCs 的体外保护作用

为评估 NPANs 在缺氧微环境下对 MSCs 的保护作用，检测了其螯合细胞内 Ca²⁺ 和清除 ROS 的能力。Fluo-4 荧光探针 CLSM 显示，生理条件下 MSCs 胞内 Ca²⁺ 荧光强度极低；离子霉素诱导 Ca²⁺ 释放后，MSCs 荧光显著增强，而 NPANs 处理组荧光明显降低（图 3a），表明 NPANs 可有效螯合 MSCs 内游离 Ca²⁺。CoCl₂ 模拟缺氧诱导 ROS 产生后，MSCs 内 ROS 积累显著增加，NPANs 处理则降低了 CoCl₂ 处理组的 ROS 水平（图 3a）。Annexin V-FITC/PI 流式细胞术显示，CoCl₂ 和离子霉素处理使 MSCs 凋亡显著增加，而 NPANs（1600 μg mL⁻¹）处理使 ROS 诱导的细胞存活率提升至 60.7%，Ca²⁺ 诱导的存活率从 59.3% 提升至 77.4%（图 3b）。CCK-8 剂量依赖性保护实验表明，300 μM CoCl₂ 使细胞存活率降至约 50%，NPANs 处理后恢复约 20%；40 μM Ca²⁺ 使存活率降低 50%，NPANs 呈剂量依赖性提升细胞活力（图 3c）。细胞因子分泌功能恢复实验显示，40 μM Ca²⁺ 使 VEGF、MCP-1、IL-6、FGF 分泌水平降低 >50%，NPANs 处理后分别恢复至对照组的 78.1%、69.5%、65.2% 和 62.1%；CoCl₂ 处理后上述因子同样降低 >50%，NPANs 处理后分别增加 156.1%、786.2%、127.6% 和 26.7%（图 3d）。转录组测序揭示，Ca²⁺ 和 CoCl₂ 处理上调促凋亡基因 Bax、Atf4、Ddit3（CHOP）、Map3k5，下调抗凋亡基因 Bcl2、Sod2、Hspa5（BIP）、Mcur1；而 1600 μg mL⁻¹ NPANs 处理显著下调促凋亡基因、上调抗凋亡基因。综上，NPANs 顺利获得调控 ER-Ca²⁺-线粒体通路关键基因表达，减轻细胞凋亡，恢复细胞因子分泌，增强 MSCs 在缺血条件下的存活和治疗效能。

图3. NPANs 对 MSCs 的体外保护作用。a) MSCs 细胞内 Ca²⁺（Fluo-4，绿色）和 ROS（FITC 通道）水平的 CLSM 图像，离子霉素（60 μM）和 CoCl₂（150 μM）分别用于升高细胞内钙和 ROS 水平，比例尺 = 20 μm；b) CoCl₂（150 μM）或 Ca²⁺（离子霉素 = 60 μM）预处理后，MSCs 与 NPANs 共培养的流式细胞术分析，Annexin V-FITC/PI 双染；c) CoCl₂ 或 Ca²⁺ 预处理后，与 NPANs 共培养的 MSCs 细胞活力（n = 6）；d) MSCs 分泌的血管生成相关因子定量（n = 3），包括 VEGF、MCP-1、IL-6 和 FGF。

（4）NPANs 促进 MSCs 在缺血性卒中中的体内存活与 MRI 示踪

活体成像显示，移植后 1 周 NPANs 标记 MSCs-GFP 在卒中区域荧光信号显著高于未标记组（296000±131046 vs 17830±8769，P < 0.05），21 天存活数量亦显著更高（84(25) vs 43(14)，P < 0.0001）。免疫荧光染色证实 NPANs 标记 MSCs-GFP 在移植位点更为丰富集中。

T₁WI 分析显示，NPANs 标记 MSCs 信号强度随浓度增加而增强，1600 μg mL⁻¹ 达平台期（图 4a），据此确定为最佳标记浓度。将 NPANs-MSCs 移植至 MCAO 模型大鼠纹状体（图 4b），活体 MRI 显示 NPANs-MSCs 组在缺血同侧脑区出现高信号，持续 21 天（图 4c）：7 天高信号主要位于纹状体，部分迁移至皮层；14 天扩展至纹状体、外囊和皮层，信号强度下降但分布范围扩大；21 天高信号持续，主要位于皮层和外侧后核。未标记 MSCs 组（图 4d）和 PBS 组（图 4e）与邻近脑区无显著差异。CNR 时间曲线显示，NPANs-MSCs 组在 7、14、21 天的 CNR 值与未标记 MSCs 和 PBS 组差异显著（图 4f）。

图4. MCAO 卒中模型中移植 MSCs 的体内 MRI 示踪与存活评估。a) 不同浓度 NPANs（200、400、800、1600、3200 μg mL⁻¹）标记 MSCs 的 T₁ MRI 信号强度（n = 3）；b) MCAO 大鼠脑立体定位注射示意图，S = 纹状体，C = 皮层；c–e) NPANs 标记 MSCs（c）、未标记 MSCs（d）和 PBS 对照（e）注射后的代表性 T₁ 加权图像；f) 缺血左侧脑增强区域的 T₁ MRI 信号强度（n = 3）。

（5）NPANs 标记 MSCs 的卒中体内治疗效果

TTC 染色显示，卒中后 7 天 NPANs-MSCs 组梗死体积较未标记 MSCs 组和 PBS 对照组显著减小（图 5a），表明 NPANs 保护的 MSCs 具有更优的治疗效果。ASL-MRI 评估脑血流恢复显示，卒中后 7 天，NPANs-MSCs 组和未标记 MSCs 组的 rCBF 均高于 PBS 组，但 NPANs-MSCs 组缺血脑区的高灌注区域更广、信号更强（图 5b）。14 天时，未标记 MSCs 组纹状体血流恢复不再增加，而 NPANs-MSCs 组纹状体和皮层的再灌注均呈进行性显著增加。21 天时，PBS 组仅在皮层发现再灌注，而 NPANs-MSCs 组在纹状体和皮层均存在再灌注，未标记 MSCs 组仅在纹状体有再灌注（图 5c）。定量分析显示，NPANs-MSCs 组纹状体 rCBF 显著高于未标记 MSCs 组（7 天 P = 0.049，14 天 P < 0.05）和 PBS 组（P = 0.002）；皮层 rCBF 同样显著高于未标记 MSCs 组（7 天 P = 0.018，14 天 P < 0.05）和 PBS 组（7 天 P < 0.0001，14 天 P = 0.002）（图 5c）。卒中后 21 天，NPANs-MSCs 组仍保持较高 rCBF。VEGF 和 CD34 免疫荧光显示，MSCs 组和 NPANs-MSCs 组梗死区 VEGF 和 CD34 表达显著高于 PBS 组，且 NPANs-MSCs 组 VEGF 表达显著高于 MSCs 组（图 5d,e）。CD34 免疫组化定量血管密度显示，NPANs-MSCs 组和 MSCs 组血管密度显著高于 PBS 组（P < 0.0001 和 P = 0.0024），且 NPANs-MSCs 组血管密度显著高于 MSCs 组（P < 0.0001）（图 5f,g）。这些结果表明，NPANs 增强的 MSCs 移植转化为更高的脑血流恢复和更大的治疗获益，改善了缺血卒中区的血管重建。

图5. NPANs 标记 MSCs 的卒中体内治疗效果。a) TTC 染色显示卒中后 7 天 NPANs-MSCs 组梗死体积较 MSCs 组和 PBS 对照组减小，红色为健康脑组织，白色为梗死区；b) NPANs-MSCs 组、MSCs 组和 PBS 对照组的脑血流（CBF）图；c) 纹状体和皮层相对脑血流（rCBF）的时空特征；d) NPANs-MSCs 组、MSCs 组和 PBS 对照组 VEGF 和 CD34 的免疫荧光染色，比例尺 = 50 μm；e) CD34 和 VEGF 荧光强度定量；f) CD34 免疫组化染色评估新生血管密度，比例尺 = 50 μm；g) 缺血脑梗死区血管面积百分比测量。

（6）NPANs 标记 MSCs 对神经行为恢复的改善

为检测 NPANs 标记 MSCs 和未标记 MSCs 对 MCAO 大鼠学习和记忆能力的影响，进行 Morris 水迷宫测试。结果显示，对照组大鼠到达隐藏平台的游泳距离长于未标记 MSCs 组，而 NPANs-MSCs 组游泳距离显著短于未标记 MSCs 组（图 6a,b）。对照组逃逸潜伏期长于未标记 MSCs 组，NPANs-MSCs 组进一步缩短（图 6c）。探针试验中，对照组目标区域平台穿越次数低于未标记 MSCs 组，而 NPANs-MSCs 组在目标象限停留时间显著长于未标记 MSCs 组（图 6d）。这些数据表明，MSCs 移植可缓解卒中诱导的学习和记忆障碍，而 NPANs 标记显著增强了这一效果。

旷场测试评估卒中后抑郁样行为。结果显示，NPANs-MSCs 组大鼠移动总距离显著大于未标记 MSCs 组和对照组，表明活动水平更高（图 6e）。对照组大鼠在周边停留时间显著多于中心，而 NPANs-MSCs 组和对照组相比在中心停留时间更长。未标记 MSCs 组总移动距离相对正常，但在中心区域停留时间少于 NPANs-MSCs 组，提示可能存在焦虑样行为。综上，NPANs 标记的 MSCs 移植显著改善了卒中后大鼠的神经行为功能。

图6. NPANs 标记 MSCs 对学习和记忆障碍的改善作用。a) Morris 水迷宫测试中 NPANs-MSCs、MSCs 和对照组的代表性游泳轨迹图；b) 三组大鼠水迷宫总游泳距离；c) 三组到达目标平台的潜伏期；d) 三组在目标区域停留时间百分比；e) 旷场测试中三组 MCAO 大鼠的总移动距离。

（7）NPANs 在细胞内钙调控及细胞功能中的作用

Cal-520 CLSM 显示，离子霉素处理后未标记 MSCs 绿色荧光显著增强并出现大量荧光囊泡，NPANs-MSCs 荧光几乎不增加，无处理时两组无差异（图 7a）。2 min 曲线显示，离子霉素处理 MSCs 荧光约 1 min 达峰后维持高位，约为对照 7 倍；NPANs-MSCs 仅短暂升高后部分下降（图 7b）。荧光酶标仪定量证实，生理条件下两组荧光相当；离子霉素处理后未标记 MSCs 荧光（1616697±32308）显著高于 NPANs-MSCs（356422±20392，P < 0.0001），达 4.5 倍（图 7c）。分子动力学模拟揭示，高钙条件（Ca²⁺:ALD = 1:2.5）下 Ca²⁺ 与 ALD 氧原子、氮原子、HPO₄²⁻ 氧原子及水分子氧原子的径向分布函数第一峰分别位于 0.288 nm、0.288 nm、0.276 nm 和 0.278 nm，配位数分别为 0.582、0.06、0.853 和 7.124；低钙条件（1:100）下与 ALD 配位可忽略（图 7d）。终态模型显示低钙条件下 Ca²⁺ 与 ALD 平均分子间相互作用能显著低于高钙条件（图 7e）。BrdU 实验显示，离子霉素处理后 NPANs-MSCs 阳性比例（58.1±13.72%）显著高于未标记 MSCs（5.80±0.92%，P = 0.0003），正常条件下无差异（P = 0.99）。Ki67 染色同样显示，离子霉素处理后 NPANs-MSCs 阳性细胞（67.50±6.60%）显著多于未标记 MSCs（18±3.25%，P < 0.0001），正常条件下无差异（P = 0.99）。划痕实验显示，离子霉素处理后 NPANs-MSCs 闭合率（37.03±1.66%）显著高于未标记 MSCs（12.88±2.72%，P = 0.0005），正常条件下相当（P = 0.97）。Transwell 显示，离子霉素处理后 NPANs-MSCs 迁移细胞数（约 117 个/视野）显著多于未标记 MSCs（约 55 个/视野，P = 0.048），正常条件下无差异（P = 0.97）。Annexin V-PI 显示，离子霉素处理后 NPANs-MSCs 凋亡率（28.65±0.73%）显著低于未标记 MSCs（67.03±%，P < 0.0001）；TUNEL 染色同样显示 NPANs-MSCs 阳性细胞（93.08±%）少于未标记 MSCs（30.42±9.77%，P = 0.0002），正常条件下无差异。

图7. MSCs 钙动态成像荧光成像及 Ca²⁺-ALD 配位模拟。a) Cal-520 负载 MSCs 的 CLSM 图像，比例尺 = 100 μm；b) 2 min 内每 3 s 采集的 MSCs 荧光强度曲线，荧光强度归一化至基线；c) 不同处理下荧光强度定量；d) 不同模拟体系中 Ca²⁺ 与 ALD 分子、HPO₄²⁻ 离子和水分子的径向分布函数及配位数；e) Ca²⁺:ALD = 1:2.5 和 Ca²⁺:ALD = 1:100 的模拟终态模型（左）和局部结构（右）。