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针对上述问题，中国科学院化学研究所白春礼、王春儒、李杰和北京大学张学慧团队开发了一种结构明确的五聚乙二醇化富勒烯衍生物 FPEG5，它具有优异的水溶性和 ROS 清除能力。机制研究表明，FPEG5 具有“双靶向”调控策略：除清除 ROS 外，它还能直接结合糖原合酶激酶-3β（GSK-3β），阻断 GSK-3β–β-catenin 的相互作用并抑制下游 NF-κB 信号通路，从而成功驱动巨噬细胞从促炎状态向促再生状态转变。随后，研究团队将 FPEG5 负载于一种由聚乙烯醇和苯硼酸类交联剂（PVA-TSPBA）制备的智能双响应水凝胶中；该水凝胶能够针对糖尿病病灶中高水平的葡萄糖和 ROS 进行特异性降解，实现药物的按需释放。在糖尿病大鼠颅骨缺损模型中，该载药水凝胶有效重塑了局部生化微环境，实现了免疫与成骨的协同耦合，显著加速了骨再生，为糖尿病骨组织工程给予了一种极具转化前景的自适应治疗策略。该文章于2026年5月14日以《A Dual-Targeting Strategy Against ROS and GSK-3β With aPEGylated Fullerene/Smart Hydrogel Synergistic System for Diabetic Bone Regeneration》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202600033）。

图1. FPEG5-PVA-TSPBA水凝胶的葡萄糖/ROS响应性释药策略示意图，以及FPEG5顺利获得双重ROS清除与靶向GSK-3β的免疫-成骨级联重编程诱导糖尿病骨再生的机制。

（1）具有抗氧化和免疫调节双重功能的聚乙二醇化富勒烯衍生物的设计

顺利获得一步反应成功合成了由3、4或5个乙二醇单元组成的聚乙二醇化富勒烯衍生物（FPEG3、FPEG4、FPEG5），其PEG基团共价结合在富勒烯笼五元环的相邻碳原子上（图2A）。动态光散色（DLS）分析显示，FPEG5在酸性、中性和碱性条件下均保持约 1 nm 的水动力学直径，在水溶液中呈单分散状态（图2B）；其Zeta电位接近中性（图2C）。电子顺磁共振（EPR）光谱显示羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O2·−）的信号减弱，证实了FPEG5的活性氧（ROS）清除能力（图2D）。细胞实验表明，FPEG3-5在高达 100 µM 的浓度下对骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）仍具有高生物相容性（图2E）。在由高糖（25 mM）和脂多糖（LPS）诱导的体外糖尿病（DM）模型中，DCFH-DA荧光探针检测显示胞内ROS水平显著升高，而FPEG5治疗以浓度依赖性方式降低了BMDMs内的ROS水平（图2F）。

流式细胞术分析显示，DM条件导致巨噬细胞M1型标记物CD86表达增加、M2型标记物CD206表达减少；经FPEG5处理后，M2型（CD206+）巨噬细胞比例呈浓度依赖性增加，M1型（CD86+）比例相应减少（图2G）。免疫荧光染色结果与之具有相同的趋势，表现为CD206荧光强度显著升高，而CD86荧光强度大幅减弱（图2H）。RT-qPCR分析同样证实，FPEG5显著降低了促炎因子IL-1β、iNOS和IL-6的mRNA表达水平，并提高了抑炎因子Ym-1的mRNA表达水平（图2I）。

图2.（A）FPEG3/4/5合成路线的示意图；（B）不同pH条件下FPEG5的流体力学直径分布；（C）FPEG3/4/5的Zeta电位测量（n=3）；（D）电子顺磁共振（EPR）光谱显示50 µM FPEG5浓度依赖性清除·OH和O2·−；（E）FPEG3/4/5处理48 h后BMDMs的活力（n=3）；（F）BMDMs细胞内ROS水平的流式细胞术检测；（G）BMDMs中M2标志物CD206和M1标志物CD86的流式细胞术分析；（H）BMDMs中CD86和CD206（绿色）、F-actin（红色）及Dapi（蓝色）染色的代表性免疫荧光图像（比例尺：25 µm）；（I）BMDMs中促炎（IL-1β、iNOS、IL-6）和抗炎（Ym-1）基因表达的RT-qPCR分析（n=3）。

（2）靶向治疗 GSK-3β 以抑制 β-Catenin/NF-κB 炎症轴

顺利获得无标记PELSA技术对经FPEG5处理与未处理的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）进行分析（图3A），筛选出GSK-3β作为潜在靶点；其激酶结构域内三个陆续在的肽段区域（残基 151–159、160–167 和 168–180）由于FPEG5的结合而增强了局部稳定性（图3B）。微标度热泳动（MST）测得FPEG5与GSK-3β的解离常数（Kd）为 4.8 µM（图3C）。细胞摄取实验表明FPEG5以内吞形式进入BMDMs。细胞热转变分析（CETSA）证实，FPEG5结合提高了完整细胞内GSK-3β的热稳定性（图3D）。分子对接与动力学模拟显示，FPEG5的PEG链与Gln151、Thr152、Arg306形成氢键，富勒烯笼与Pro154、Pro351产生疏水相互作用，紧密结合于GSK-3β口袋（PDB: 6AE3），该预测位点与PELSA鉴定出的稳定肽段一致（图3E，图3B）。在糖尿病（DM）条件下，FPEG5未改变总GSK-3β水平，但显著降低了β-catenin的磷酸化水平（图3F）。免疫共沉淀（Co-IP）证实，FPEG5阻断了GSK-3β与β-catenin的相互作用（图3G），从而抑制β-catenin的降解并使其总水平略有上升（图3F）。使用GSK-3β激活剂DIF-3会增加β-catenin磷酸化并促进M1型极化，该效应可被FPEG5逆转（图3H,I）。基因敲低（KD）实验表明，野生型细胞经FPEG5处理后或敲低GSK-3β后均向M2型极化，但在GSK-3β缺陷的巨噬细胞中，加用FPEG5处理未导致极化程度产生显著统计学差异（图3J）。蛋白质印迹分析证实，在DM条件下，巨噬细胞顺利获得IκBα降解、p65磷酸化及p65表达量增加激活了NF-κB通路；而FPEG5治疗维持了IκBα的稳定性，并抑制了p65的磷酸化和整体表达（图3K）。综合上述结果，FPEG5顺利获得直接结合并抑制GSK-3β以稳定β-catenin，同时结合其ROS清除能力，协同增强IκBα的稳定性，阻断NF-κB介导的炎症反应，从而在高糖微环境中将巨噬细胞从促炎M1型重塑为促再生M2型（图3L）。

图3. PEG化富勒烯顺利获得靶向GSK-3β驱动巨噬细胞重极化。（A）PELSA实验流程示意图；（B）配体结合区域的局部稳定性谱图；（C）MST曲线显示FPEG5与GSK-3β的结合；（D）CETSA评估FPEG5与GSK-3β的相互作用；（E）FPEG5与GSK-3β的分子对接模型及结合模式；（F）FPEG5处理后GSK-3β通路相关蛋白的Western blot分析；（G）Co-IP/Western blot分析GSK-3β与β-catenin的相互作用；（H）药物激活后GSK-3β通路活性的Western blot分析；（I）激动剂和FPEG5处理后BMDMs中CD206和CD86的流式细胞术分析；（J）siGSK-3β及FPEG5处理后BMDMs中CD206和CD86的流式细胞术分析；（K）FPEG5对NF-κB通路调控的Western blot分析；（L）FPEG5顺利获得双靶向GSK-3β和ROS促进巨噬细胞重极化的机制示意图。

（3）FPEG5 在体外促进成骨分化

利用Transwell共培养系统，将经FPEG5处理的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）与小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）进行共培养，用以评估糖尿病（DM）条件下的成骨诱导潜能（图4A）。结果显示，在第4天和第7天，FPEG5以浓度依赖性方式显著提高了关键成骨基因（BMP-2、RUNX-2、COL1、OPN、SP7）的mRNA表达水平（图4B,C）。第4天的蛋白质印迹（Western blot）与免疫荧光分析共同证实，FPEG5（及FPEG5-PVA-TSPBA）显著增强了mBMSCs中OPN和BMP-2的蛋白表达（图4D,E）。成骨分化功能检测显示，在第7天，FPEG5组表现出更强的碱性磷酸酶（ALP）活性与染色深度，定量分析结果与染色趋势一致（图4F）；在第14天，茜素红S（ARS）染色显示FPEG5诱导了更多的钙结节形成和矿物质沉积（图4F）。上述结果表明，在模拟糖尿病的病理条件下，FPEG5能够顺利获得免疫-成骨耦合效应或直接调节GSK-3β活性，显著增强BMSCs的成骨分化与矿化能力。

图4. PEG化富勒烯诱导巨噬细胞重编程促进体外成骨分化。（A）Transwell共培养系统示意图；（B、C）第4天（B）和第7天（C）mBMSCs成骨标志基因（BMP-2、RUNX-2、COL1、OPN、SP7）的RT-qPCR分析（n=3）；（D）第4天mBMSCs中OPN、F-actin和Dapi染色的免疫荧光图像；（E）第4天mBMSCs中BMP-2、F-actin和Dapi染色的免疫荧光图像；（F）mBMSCs的ALP染色（第7天）和ARS染色（第14天）。

（4）构建用于 FPEG5 按需释放的智能葡萄糖/ROS 双响应水凝胶

FPEG5-PVA-TSPBA水凝胶由FPEG5负载PVA与TSPBA交联剂顺利获得动态硼酸酯键形成（图5A）。7.5%（w/v）FPEG5-PVA与2.5%（w/v）TSPBA的配比具有适宜的凝胶时间（图5B），并可注射成型（图5C）。该水凝胶在PBS中14天内体积损失最小，在高糖或高ROS环境中发生时间依赖性降解，在糖尿病模拟条件下完全崩解（图5D），FPEG5累积释放率超过90%（图5E）。SEM显示水凝胶具有均匀多孔结构，FPEG5的引入减小了孔径（图5F），同时显著提高了抗压强度和弹性模量（图5G）。

图5. 负载PEG化富勒烯的葡萄糖/ROS响应型水凝胶系统的制备与表征。（A）水凝胶的葡萄糖/ROS响应性降解及药物释放机制示意图；（B）不同浓度PVA溶液的凝胶动力学（n=3）；（C）预凝胶溶液双筒注射可注射性示意图；（D）水凝胶在PBS、高糖、高H2O2及糖尿病模拟培养基中孵育14天的宏观降解照片；（E）不同条件下FPEG5的累积释放曲线；（F）水凝胶内部微观结构的SEM图像；（G）水凝胶的抗压强度（左）和弹性模量（右）（n=3）。

（5）促进糖尿病骨体内再生

在糖尿病大鼠颅骨临界缺损模型中（图6A），Micro-CT显示DM组骨再生显著受损，而FPT组（FPEG5-PVA-TSPBA水凝胶）在第4周时缺损几乎被新骨填充，第8周实现广泛骨桥接，骨体积分数（BV/TV）达45.29%，显著优于对照组、DM组和PT组（图6B）。H&E和Masson三色染色证实FPT组在第4周即形成排列良好的层状骨和丰富的胶原沉积，第8周实现完全缺损闭合及成熟骨组织整合（图6C）。术后第7天流式细胞术显示FPT组显著降低M1型巨噬细胞比例并增加M2型巨噬细胞比例（图6D），免疫荧光染色进一步证实FPT促进M1向M2表型转换（图6E）。

图6. FPEG5-PVA-TSPBA促进糖尿病骨再生。（A）糖尿病大鼠或db/db小鼠颅骨临界缺损手术及水凝胶植入示意图；（B）术后4周和8周缺损部位的三维micro-CT重建图像；（C）术后4周和8周缺损区H&E和Masson三色染色切片；（D）术后1周缺损部位M2（CD206+）和M1（CD86+）巨噬细胞群体的流式细胞术分析；（E）术后1周缺损区CD86和CD206的免疫荧光染色图像。