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针对上述问题，山东大学齐鲁医院张澄教授、张猛教授团队，首次揭示了巨噬细胞内源性激酶SBK2的抗动脉粥样硬化作用。SBK2直接结合并磷酸化NLRP3蛋白的Ser161位点，招募自噬受体Tollip，引导NLRP3进入选择性自噬-溶酶体降解途径，从而阻断炎症小体组装。基于这一机制，团队顺利获得高通量筛选发现天然小分子化合物莱鲍迪苷N（Rebaudioside N, RN）可高效激活SBK2。在LDLR-/-小鼠模型中，RN显著减小斑块负荷、改善斑块稳定性，且不依赖降脂通路。该文章于2026年2月13日以《Macrophage SBK2 suppresses inflammation and atherosclerosis by NLRP3 phosphorylation》为题发表于《European Heart Journal》（DOI：10.1093/eurheartj/ehag047）。

研究机制原理图

（1）SBK2在晚期动脉粥样硬化斑块巨噬细胞中表达升高

为探究SBK2在动脉粥样硬化中的潜在作用，研究团队第一时间分析了小鼠主动脉单细胞测序数据（GSE155513），识别出8种细胞类型。对比高脂喂养26周与0周的巨噬细胞，发现22个激酶基因上调、50个下调，其中SBK2和FLT3在巨噬细胞中特异性富集（图1A-1D）。值得注意的是，SBK2在斑块进展期（16周、26周）巨噬细胞中的表达显著高于早期（8周）（图1E）。顺利获得Western blot和免疫荧光，团队在小鼠主动脉组织和人冠状动脉斑块中均证实：SBK2主要表达于巨噬细胞，且在重度狭窄的晚期斑块中表达更高（图1I-1J）。oxLDL刺激可剂量依赖性地诱导原代小鼠腹腔巨噬细胞和人单核来源巨噬细胞（HMDMs）中SBK2蛋白水平升高（图1K-1L）。临床样本分析显示，动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞（PBMCs）中SBK2 mRNA水平显著高于健康对照，且与血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18水平呈正相关（图1Q-1R）。这些发现共同提示，SBK2在斑块微环境中被oxLDL诱导上调，且在患者体内与炎症因子水平正相关，可能是巨噬细胞内在的一个应激反应分子。

图1. 巨噬细胞SBK2表达在动脉粥样硬化斑块进展中升高。（A）高脂喂养0、8、16、26周LDLR-/-小鼠主动脉单细胞测序鉴定出8种细胞类型；（B-C）26周与0周相比，巨噬细胞中SBK2为差异最显著上调激酶之一；（D-E）SBK2主要定位于巨噬细胞簇，且斑块进展期（16周、26周）表达显著高于早期（8周）；（F-G）Western blot和qPCR证实SBK2在原代腹腔巨噬细胞高表达，主动脉平滑肌细胞和内皮细胞几乎不表达；（H-I）小鼠及人冠状动脉斑块免疫荧光显示晚期/重度狭窄斑块巨噬细胞SBK2表达高于早期/轻度；（J）全主动脉Western blot证实晚期斑块SBK2蛋白水平升高；（K-L）ox-LDL剂量依赖性诱导小鼠腹腔巨噬细胞和人单核来源巨噬细胞SBK2表达；（M-P）GSE113079、GSE90074、GSE58967、GSE62646数据库RNA-Seq均显示动脉粥样硬化患者SBK2升高；（Q）78例患者与30例健康对照相比，PBMCs中SBK2 mRNA显著升高；（R）SBK2 mRNA水平与血清炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18）呈正相关。

（2）SBK2缺失促进动脉粥样硬化斑块进展

为明确SBK2的功能，团队构建了SBK2全身敲除（SBK2-KO）和巨噬细胞特异性敲除（SBK2^M-KO）小鼠，顺利获得AAV-PCSK9联合高脂饮食诱导动脉粥样硬化。全身敲除结果显示，SBK2-KO小鼠主动脉斑块面积较野生型小鼠增加约63%，斑块内脂质沉积增多、坏死核心扩大、胶原减少、纤维帽变薄。巨噬细胞特异性敲除进一步证实，SBK2^M-KO小鼠斑块负荷增加约64%，且在LDLR-/-背景中，雌雄小鼠均表现出一致的斑块加重表型：斑块面积增大、脂质积累增加、巨噬细胞浸润增多、坏死核心扩大，同时胶原含量和纤维帽厚度减少（图2A-2F）。值得注意的是，这些表型变化不伴随体重或血脂水平的改变，说明SBK2是顺利获得非降脂途径抑制动脉粥样硬化的。

图2. 巨噬细胞SBK2缺乏促进动脉粥样硬化。（A）雄性SBK2^M-WT/LDLR-/-与SBK2^M-KO/LDLR-/-小鼠主动脉弓原位斑块图像及全主动脉油红O染色代表图与定量分析（n=12）；显示SBK2缺失组斑块面积显著增加；（B-C）雄性小鼠主动脉根部切片染色（HE、油红O、天狼星红、Masson及MOMA-2免疫荧光）代表图与定量分析（n=10）；显示SBK2缺失导致斑块面积增大、脂质沉积增多、坏死核心扩大、胶原含量减少、纤维帽变薄；（D）雌性SBK2^M-WT/LDLR-/-与SBK2^M-KO/LDLR-/-小鼠主动脉弓原位斑块图像及全主动脉油红O染色代表图与定量分析（n=12）；结果与雄性小鼠一致；（E-F）雌性小鼠主动脉根部切片染色（HE、油红O、天狼星红、Masson及MOMA-2免疫荧光）代表图与定量分析（n=10）；证实SBK2缺失对雌雄小鼠均加重动脉粥样硬化。

（3）SBK2缺失特异性激活NLRP3炎症小体

为分析SBK2缺失为何加重斑块，团队对SBK2^M-KO和对照小鼠的主动脉进行了单细胞RNA测序。结果显示，SBK2^M-KO小鼠斑块中巨噬细胞比例增加，平滑肌细胞比例减少（图3A-3D）。差异基因富集分析表明，上调基因显著富集于“先天免疫应答调控”和“炎症信号激活”通路，其中Tnf、Tlr4、Il18、Nlrp3、Ccl8、Ccl6等炎症相关基因表达上调（图3C-3E）。免疫组化也证实SBK2^M-KO斑块中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平更高（图3F）。关键的体外实验揭示，单独用oxLDL或LPS刺激时，SBK2缺失不影响TNF-α、IL-6等细胞因子的mRNA水平，也不影响MAPK或NF-κB磷酸化；但在NLRP3炎症小体激活条件（LPS+ATP或LPS+胆固醇结晶）下，SBK2缺陷巨噬细胞的IL-1β和IL-18分泌显著增加，而TNF-α和IL-6不受影响（图3G-3H）。Western blot进一步显示，SBK2缺陷巨噬细胞中NLRP3蛋白水平升高，且上清中caspase-1 p20和成熟IL-1β p17增多（图3J-3K）。体内实验也证实，SBK2^M-KO小鼠在LPS注射后血清IL-1β水平显著升高，而TNF-α和IL-6无变化（图3L-3M）。这些结果共同证明，SBK2特异性抑制NLRP3炎症小体，而非广谱抑制所有炎症通路，为精准抗炎给予了分子基础。

图3. 巨噬细胞SBK2缺乏加剧体内外炎症反应。（A）点阵图展示平滑肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、树突状细胞、T细胞和神经元细胞的关键标志基因表达；（B）UMAP图展示SBK2^M-WT与SBK2^M-KO小鼠主动脉中各细胞类型分布；（C）GO富集分析显示SBK2^M-KO巨噬细胞上调基因富集于先天免疫应答和炎症信号激活；（D）SBK2^M-KO小鼠斑块巨噬细胞比例增加，平滑肌细胞减少；（E）SBK2^M-KO小鼠巨噬细胞中Tnf、Tlr4、Il18、Nlrp3、Ccl8、Ccl6等炎症基因显著上调；（F）免疫组化显示SBK2^M-KO小鼠斑块TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白水平显著高于对照（n=10）；（G-H）ELISA显示LPS+ATP、LPS+胆固醇结晶或oxLDL刺激下，SBK2^M-KO巨噬细胞IL-1β和IL-18分泌显著增加，TNF-α和IL-6无变化（n=6）；（I）HMDMs敲低SBK2后，oxLDL刺激下IL-1β和IL-18分泌增加，TNF-α和IL-6无变化（n=6）；（J-K）Western blot显示SBK2^M-KO巨噬细胞NLRP3升高，上清中caspase-1 p20和成熟IL-1β p17增多，pro-caspase-1、ASC和pro-IL-1β无变化（n=6）；（L-M）SBK2^M-KO小鼠经LPS注射后血清IL-1β显著高于对照，TNF-α和IL-6无变化（n=8）。

（4）SBK2顺利获得Tollip介导的选择性自噬降解NLRP3

既然SBK2不影响NLRP3的mRNA水平（图4B），团队进一步探究其如何调控NLRP3蛋白稳定性。CHX放线菌酮追踪实验显示，SBK2缺失显著减缓了NLRP3蛋白的降解速率（图4D）。过表达实验表明，SBK2可降低NLRP3水平，该作用可被自噬抑制剂3-MA和溶酶体抑制剂CQ阻断，而不被蛋白酶体抑制剂MG132阻断（图4F）。在ATG5或BECN1敲低/敲除细胞中，SBK2无法再诱导NLRP3降解（图4G-4H），且SBK2过表达可促进NLRP3与自噬标志物LC3的共定位（图4I），这些结果证实SBK2诱导的NLRP3降解是顺利获得自噬-溶酶体途径实现的。为进一步识别负责识别磷酸化NLRP3的自噬受体，团队顺利获得免疫共沉淀发现NLRP3可与p62、Tollip、NDP52结合（图4J），但SBK2过表达仅增强NLRP3与Tollip的相互作用，而不增强与p62或NDP52的结合（图4K）。邻近连接分析（PLA）进一步验证了这一发现（图4L）。功能上，Tollip敲低完全消除了SBK2诱导的NLRP3降解，而p62或NDP52敲低则无影响（图4M-4O）。这些发现首次揭示SBK2顺利获得Tollip介导的选择性自噬降解NLRP3，这是一个此前未被报道的调控模式。

图4. SBK2顺利获得Tollip介导的选择性自噬促进NLRP3降解。（A）流式细胞术显示SBK2敲低后oxLDL刺激的HMDMs中NLRP3蛋白水平升高（n=6）；（B）qPCR显示SBK2缺失不影响NLRP3 mRNA表达（n=6）；（C）免疫荧光显示SBK2^M-KO小鼠斑块巨噬细胞NLRP3荧光强度显著高于对照（n=10）；（D）CHX追踪实验显示SBK2缺失减缓NLRP3蛋白降解速率（n=6）；（E）THP1细胞过表达SBK2显著降低NLRP3蛋白水平（n=6）；（F）自噬抑制剂3-MA和溶酶体抑制剂CQ阻断SBK2诱导的NLRP3降解，蛋白酶体抑制剂MG132无此作用（n=6）；（G-H）敲低ATG5或BECN1后，SBK2无法再诱导NLRP3降解（n=6）；（I）共聚焦显微镜显示SBK2过表达促进NLRP3与LC3共定位；（J）免疫共沉淀显示NLRP3可与p62、Tollip、NDP52三种自噬受体结合；（K）SBK2过表达仅增强NLRP3与Tollip的相互作用（n=6）；（L）PLA验证SBK2过表达特异性增强NLRP3与Tollip结合；（M-O）敲低Tollip完全消除SBK2诱导的NLRP3降解，敲低p62或NDP52无影响（n=6）。

（5）SBK2直接结合NLRP3并磷酸化其Ser161位点

作为蛋白激酶，SBK2是否直接作用于NLRP3？免疫共沉淀实验证实，SBK2与NLRP3特异性结合，但不与CASP1或ASC结合（图5A-5D），PLA和共聚焦显微镜进一步验证了二者的原位相互作用（图5E-5F）。结构域分析显示，SBK2的N端和中段与NLRP3的NOD和LRR结构域负责结合。磷酸化方面，SBK2缺失导致NLRP3的丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平显著降低（图5G）；激酶失活突变体SBK2^KD无法磷酸化NLRP3，也无法诱导其降解（图5H）。体外激酶实验进一步确认，纯化的SBK2^WT可直接磷酸化NLRP3，而SBK2^KD不能（图5I）。质谱鉴定发现NLRP3的S161、S163、S198位点被磷酸化（图5J），进一步的点突变实验表明，S161A突变完全阻断SBK2介导的NLRP3降解和磷酸化，而S163A或S198A无影响（图5K）。团队还制备了特异性识别小鼠NLRP3 pS157（对应人S161）的磷酸化抗体，在SBK2^M-KO小鼠组织和细胞中pS157水平显著降低（图5M-5N）。这些结果共同证明，SBK2是NLRP3 S161（小鼠S157）的直接上游激酶，该磷酸化是后续自噬降解的“启动信号”。

图5. SBK2与NLRP3相互作用并直接磷酸化其Ser161位点。（A）HEK293T细胞中免疫共沉淀显示：SBK2与NLRP3结合；而不与CASP1或ASC结合；（B-C）反向免疫共沉淀进一步证实：SBK2与NLRP3之间存在特异性相互作用；（D）小鼠原代腹腔巨噬细胞中内源性免疫共沉淀证实：SBK2与内源性NLRP3结合；（E-F）邻近连接分析（PLA）显示：SBK2与NLRP3在oxLDL刺激的腹腔巨噬细胞和HMDMs中存在原位相互作用（标尺=5μm）；（G）SBK2缺失导致NLRP3的丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平显著降低；（H）激酶失活突变体SBK2^KD无法磷酸化NLRP3；也无法诱导其降解；而SBK2^WT可有效磷酸化并降解NLRP3（n=6）；（I）体外激酶实验证实：纯化的SBK2^WT可直接磷酸化NLRP3；而SBK2^KD不能（n=6）；（J）跨物种序列比对显示NLRP3 Ser161位点高度保守（上图）；质谱鉴定证实SBK2介导NLRP3 Ser161位点磷酸化（下图）；（K）在NLRP3-KO BMDMs中回补WT NLRP3时；SBK2可有效诱导其降解和磷酸化；而回补S161A突变体时；SBK2无法诱导降解和磷酸化（n=6）；（L）ELISA显示：SBK2可显著抑制WT NLRP3回补细胞的IL-1β分泌；而对S161A回补细胞无抑制作用（n=6）；（M）SBK2^M-KO小鼠腹腔巨噬细胞中；pS157（对应人S161）水平显著低于对照组（n=6）；（N）主动脉根部免疫组化显示：SBK2^M-KO小鼠斑块中pS157水平显著低于对照组（n=10；标尺=100μm）。

（6）SBK2过表达抑制炎症和斑块进展，且依赖激酶活性

在明确了SBK2的作用机制后，团队进一步验证了增强SBK2功能是否能够抑制炎症和动脉粥样硬化。在巨噬细胞中过表达野生型SBK2（SBK2^WT），可显著抑制oxLDL或LPS+ATP诱导的IL-1β和IL-18分泌（图6A-6B），并降低NLRP3蛋白及caspase-1 p20和成熟IL-1β p17的水平；而激酶失活突变体SBK2^KD则无效（图6C）。在体内实验中，团队顺利获得AAV在LDLR-/-小鼠巨噬细胞中特异性过表达SBK2^WT（图6D），结果显示主动脉斑块面积减少约39%（图6E-6F），同时斑块稳定性显著改善：胶原含量增加、坏死核心减小、纤维帽增厚，并伴随pS157水平升高和NLRP3/IL-1β表达下降（图6G-6H）。雌性小鼠中观察到一致的结果。这些发现证明，巨噬细胞SBK2以激酶活性依赖的方式抑制炎症和动脉粥样硬化进展。

图6. 巨噬细胞中SBK2过表达有效抑制炎症和动脉粥样硬化进展。（A和B）Ad-Ctrl、Ad-SBK2ᵂᵀ或Ad-SBK2ᴷᴰ预处理24 h、PBS或oxLDL（100 μg/mL）刺激24 h的腹腔巨噬细胞和HMDMs上清液中IL-1β和IL-18蛋白水平的ELISA（n=6）。（C）Ad-Ctrl、Ad-SBK2ᵂᵀ或Ad-SBK2ᴷᴰ预处理24 h、PBS或oxLDL（100 μg/mL）刺激24 h的腹腔巨噬细胞细胞上清液和细胞裂解液蛋白表达的代表性Western blot图像（n=6）。（D）构建动脉粥样硬化模型的示意图：雄性LDLR⁻/⁻小鼠经尾静脉注射AAV-Ctrl、AAV-SBK2ᵂᵀ或AAV-SBK2ᴷᴰ，随后高脂饮食（HFD）喂养10周。（E）各组主动脉弓动脉粥样硬化的代表性原位图像（n=10）。（F）3组全主动脉动脉粥样硬化病变的代表性油红O染色图像及定量（n=10）。（G和H）3组主动脉根部切片中HE染色、油红O、Masson染色、MOMA-2（单核细胞/巨噬细胞）免疫荧光染色、IL-1β免疫组化染色和巨噬细胞中NLRP3免疫荧光成像的代表性图像及定量分析（n=10），比例尺=200 μm。数据以mean±SEM表示。

（7）NLRP3抑制剂MCC950可挽救SBK2缺失所诱导的表型

为了确认SBK2的功能是否确实顺利获得NLRP3介导，团队使用了特异性NLRP3抑制剂MCC950进行功能回复实验。在细胞层面，MCC950处理SBK2^M-KO巨噬细胞可完全阻断IL-1β和IL-18的过度分泌（图7A），并降低caspase-1 p20和成熟IL-1β p17水平（图7B）。在体内实验中，MCC950治疗SBK2^M-KO/LDLR-/-小鼠可显著减少斑块面积、脂质沉积和坏死核心，同时增加胶原含量和纤维帽厚度（图7C-7F）。这些结果直接证明，SBK2缺失所导致的动脉粥样硬化加重确实是顺利获得上调NLRP3炎症小体活性介导的，进一步验证了SBK2-NLRP3调控轴的核心地位。

图7. 抑制NLRP3可改善SBK2敲除在体内外诱导的表型。（A）ELISA检测显示：MCC950（NLRP3特异性抑制剂）预处理可完全阻断SBK2^M-KO巨噬细胞中oxLDL诱导的IL-1β和IL-18过度分泌（n=6）；（B）Western blot显示：MCC950处理可显著降低SBK2^M-KO巨噬细胞上清中caspase-1 p20和成熟IL-1β p17水平；同时降低细胞内NLRP3蛋白水平（n=6）；（C）雄性SBK2^M-WT/LDLR-/-与SBK2^M-KO/LDLR-/-小鼠主动脉弓原位斑块图像显示：MCC950治疗可显著减少SBK2缺失所致的斑块增大；（D）全主动脉油红O染色及定量分析显示：MCC950治疗显著降低了SBK2^M-KO/LDLR-/-小鼠的斑块面积（n=8）；（E-F）主动脉根部切片染色（HE、油红O、Masson及MOMA-2免疫荧光）及定量分析显示：MCC950治疗显著抑制了SBK2缺失所致的斑块面积增大、脂质沉积增多、巨噬细胞浸润增加、坏死核心扩大、胶原减少和纤维帽变薄（n=8）。

（8）天然化合物RN选择性激活SBK2，并依赖SBK2发挥抗动脉粥样硬化作用

鉴于SBK2的抗动脉粥样硬化功能，团队进行了小分子化合物库的高通量筛选，发现天然化合物莱鲍迪苷N（RN）能显著增强SBK2的激酶活性（图8A）。分子对接实验显示RN与SBK2活性口袋中的关键残基稳定结合（图8B），细胞热位移实验进一步证实RN可直接结合SBK2并提高其热稳定性（图8C-8D）。在细胞水平，RN以浓度依赖的方式抑制oxLDL或LPS+ATP诱导的IL-1β和IL-18分泌（图8E-8F），降低NLRP3蛋白及caspase-1 p20和成熟IL-1β p17的水平（图8G）。在动物水平，LDLR-/-小鼠每日腹腔注射RN（1 mg/kg）持续10周（图8H），主动脉斑块面积减少约40%（图8I-8J），斑块稳定性显著改善，且不改变血脂水平和肝肾功能（图8K-8L）。最为关键的是，在SBK2^M-KO巨噬细胞或SBK2^M-KO/LDLR-/-小鼠中，RN完全失去了抗炎和抗动脉粥样硬化作用，这严格证明了RN的治疗效果是SBK2依赖性的。

图8. 激活SBK2是缓解动脉粥样硬化的潜在治疗方法。（A）ADP-glow激酶活性检测显示RN可显著增强SBK2激酶活性（以RLU表示）；（B）分子对接预测显示莱鲍迪苷N（RN）与SBK2活性口袋关键残基形成稳定结合；（C-D）CETSA证实RN可直接结合SBK2并提高其热稳定性，呈温度依赖性（n=4）和剂量依赖性（n=6）；（E-F）ELISA显示RN预处理浓度依赖性抑制oxLDL诱导的腹腔巨噬细胞和HMDMs中IL-1β和IL-18分泌（n=6）；（G）Western blot显示RN降低NLRP3蛋白水平及上清中caspase-1 p20和成熟IL-1β p17，pro-caspase-1、ASC和pro-IL-1β无变化（n=6）；（H）体内实验示意图：8周龄雄性LDLR-/-小鼠每日腹腔注射RN（1 mg/kg）或生理盐水，高脂喂养10周；（I）主动脉弓原位斑块图像显示RN治疗组斑块明显减小（n=12）；（J）全主动脉油红O染色显示RN治疗组斑块面积减少约40%（n=12）；（K-L）主动脉根部切片染色及定量分析显示RN治疗组斑块面积减小、脂质沉积减少、巨噬细胞浸润减少、坏死核心缩小、胶原含量增加、纤维帽增厚，IL-1β和NLRP3表达下降（n=10；标尺=200μm）。